酶法多肽技术简介

酪蛋白磷酸肽(CPP)的生理功能

http://www.whjst.com    20060420   信息来源:中国肽谷·九生堂

 

世界著名多肽科学家       邹远东

 

机体对无机钙的吸收,必须以可溶性状态由小肠吸收,但小肠下部的pH为中性至弱碱性,易使无机钙产生沉淀而形成不溶物,这样势必影响钙的吸收。由酪蛋白制成的酪蛋白磷酸肽(Casein PhosphopeptidesCPP),可防止无机钙的沉淀,故可促进小肠对钙的吸收。

酪蛋白磷酸肽的研究可追溯到1957年。酪蛋白通过胰蛋白酶分解得到的部分水解物酪蛋白磷肽比较稳定,不易被进一步水解,它与钙、铁等金属离子具有较强的亲和性,可形成可溶性复合体。临床研究已证实,让患有佝偻病的幼儿摄入CPP,对促进其骨骼生长效果良好。

 

酪蛋白磷酸肽(CPP)的理化性质

 

50年前,有人报道了酪蛋白的胰蛋白酶水解物中含有一种富磷酸多肽,在不依赖维生素D的情况下,促进了佝偻病患儿骨骼的钙化,并将之命名为酪酸肽(CPP)。此后,许多研究者致力于CPP的结构分析、使用机制和生理效果的研究。

有学者在体外从酪蛋白的水解物中分离出CPP并证明它可防止磷钙形成。Naito等从含酪蛋白的大鼠肠腔内容物中分离出CPP,证明其与体外制备的CPP具有相同的对钙离子的亲和性。此后,许多研究证明,CPP的存在可以阻止小肠远端不溶性磷酸钙沉淀的形成,从而提高肠腔可溶性钙的浓度。

CPP对钙的亲和性可归因于磷酸丝氨酸残基的高极性和酸性区域对磷酸钙胶体的稳定作用。Baumy等利用31P核磁共振研究了合成磷酸丝氨酸、β-酪蛋白和其产生的β-CPP125)中Ser-P与钙的结合,证明了CPPSer-P邻近的氨基酸残基对其理化性质的影响,特别是对阳离子的结合能力。在β-CPP1254P中,4个磷酸丝氨酸(Ser-P)残基分别位于第15171819位,与钙离子的结合,首先发生在具有较高pK的第171819位,当这些位置饱和后,才与pK较低的第15位结合。

科学家对CPP抑制磷酸钙沉淀的机理作如下解释:磷酸钙在初步形成时是无定形的,之后逐渐变成晶体形式,CPP粘附在其表面,阻止结晶长大。大量的肠内溶解钙以很高的频率和CPP不断接触,这些离子在不受磷酸根作用的状态下被带到肠粘膜,CPP起着调节晶体成长的作用。

在体外的模拟实验中,证明CPP能显著地延缓或阻止难溶性磷酸盐结晶的形成。有学者在模拟小肠下部理想环境下(pH7.037),将1m1 20mmo1/L Na3PO4,溶液加入0.25ml 20mmo1/L Ca2+40ug β-CPP的混合溶液中,024小时后,离心除去沉淀,测定清液中钙的浓度,只有CPP和聚谷氨酸有阻止磷酸沉淀的效果,而脱磷化CPP和大豆消化肽则无效。

CPP不仅对Ca2+具有亲和性,而且对Fe2+Zn2+等二价金属具有相似的作用。

用离子交换层析纯化的CPP,以酸性磷酸酶(EC3.1.3.2)进行脱磷化处理,得到脱磷肽(Dephophorylated PeptideDPP),用CPPDPP进行物理化学性质比较试验。以离子选择性电极法测它们与钙的结合,发现CPPCa2+的结合随着pH值的升高而增加,在pH6.5pH7.6,结合钙与CPP中的有机磷的比(Ca/Porg)为1/1DPPCa2+没有明显的结合。CPP在不同的Ca/P下都能有效地阻止不溶性磷酸钙的产生,这种作用的有效CPP浓度是10mg/L,而完全稳定磷酸钙溶液所需的浓度是100mg/L。这种稳定作用依赖于有机磷的存在。

 

酪蛋白磷酸肽(CPP)生理功能

 

1. CPP可促进钙的吸收

钙在小肠的吸收可分为主动运输和被动吸收两种机制。首先,在十二指肠及空肠上端(小肠上部)以可饱和的主动运输方式吸收钙,此过程需由维生素D通过其分子产物——钙结合蛋白(CaBP)来调节;然后在回肠及小肠末端(小肠下部)主要以不饱和的扩散输送方式被动吸收。就小肠整体而言,下部的吸收面积远大于上部,小肠下部钙的吸收量占总吸收量的75%80%。被动吸收不直接受到机体功能、营养状况、年龄等因素的影响,而与肠腔内钙离子浓度和渗透压密切相关。在正常的生理状况下,小肠中下部被动吸收的区域是影响钙平衡的主要部分,只需要增进小肠末端对钙的吸收。由食物中摄入的钙,在胃和小肠的酸性条件下,能处于良好的溶解状态,但到小肠中部pH78弱碱性环境下,钙离子极易形成不溶性盐沉淀,阻碍了钙的扩散输送,导致吸收率下降。

CPP由于对二价金属的亲和性,能与钙在小肠这种弱碱性环境形成可溶性络合物,这种中等强度的可交换结合即能有效地防止磷酸钙沉淀的形成而增加可溶性钙的浓度,又不妨碍与肠粘膜的交换,从而促进肠内钙的吸收。同时,由于CPP分子带有高浓度的电荷,使它们能够抵抗肠内消化酶的进一步水解,这一性质成为其在肠道发挥作用的前提保证。

 

2. CPP促进钙吸收的效果

早在50年代,国外首先报道了来自于酪蛋白的酶水解物磷酸肽,在不依赖维生素D的条件下,促进了佝偻病患儿骨骼的钙化,随后的早期研究,以CPP促进佝偻病雏鸡的骨骼钙化和增加大鼠钙吸收的结果,支持了Mellader的发现。从20世纪70年代开始,人们通过肠管结扎法、同位素示踪法、钙平衡试验等多种手段进行了CPP与钙吸收关系的动物直至人体试验,在这方面,科学家进行了大量研究。

有学者以大鼠肠管结扎法进行钙吸收实验,发现CPP-组的钙吸收率是对照组的23倍。又以大鼠管饲法给予45Ca观察钙的吸收,CPP添加组钙向血中移行是对照组的20多倍。表明CPP对小肠下部钙的被动吸收的影响。

以大鼠管饲法给予59Fe,然后跟踪血液、肝脏、大腿骨等处Fe的移行。CPP组血液中59Fe的浓度为对照组的1020倍,表明CPP通过维持Fe的可溶性,促进其在肠道内的吸收并向各器官输送。

研究人员给予缺铁性贫血患者铁剂100mgCPP- 400mg,服用一周后,CPP组的血清铁及血色素比对照组高2倍。

按不同的CPP/Ca比例进行了生长期大鼠钙平衡实验,当饲料中CPP含量为钙含量的0.35倍以上时,钙的吸收率和保留量均显著提高。并且CPP添加组大腿骨重量及钙含量均比对照组增大。

有研究认为CPP在低钙水平下(﹤0.4%)才具有显著的效果,但KittsGoto、张亚等非动物实验饲料钙水平高至0.5%1.5%时,CPP仍具有显著提高吸收率和储留率的效果。

科学试验表明:以酪蛋白磷酸肽(CPP)与钙元素的科学配方制作而成的酪蛋白磷酸肽钙(CPPC)可能是当今真正能够补钙的健康品。

 

3. CPP的抗龋齿功能

研究发现,CPP中具有—SerP—SerP—SerP—Glu—Glu片段的肽具有抗龋齿功能,并称之为抗龋齿酪蛋白磷酸肽(Anticariogenic Casein Phospho PeptidesACPP),CPP中含有约86%ACPP

ACPP的作用机制是:具有上述磷酸丝氨酸结构的多肽通过络合作用稳定非结晶磷酸钙并使之集中在牙斑部位,而非结晶磷酸钙则充当游离子和磷酸根离子的缓冲剂,从而防止牙细菌产生的酸对牙釉质的脱矿质作用。多项体外动物和人体实验证明ACPP有以下作用:

1)可显著降低羟基磷灰石(牙齿的主要成分)的腐蚀溶解率。

2)能携带再矿化和抗菌离子(例如Ca2+Po3-Zn2+Cu2+Fe2+)在牙斑部位富集。

3)对糖溶液具有显著的防止pH下降的缓冲作用。

ACPP是目前唯一不同于氟化物的抗龋齿添加剂,澳大利亚墨尔本大学将ACPP加入一种糖果中,发现这种糖果诱发龋齿的危险性大大降低。

 

酪蛋白磷肽在功能性食品中的应用

 

由于CPP对钙等矿物质的吸收具有促进作用,故可在多种功能性食品中加以应用。但CPP单独使用的意义不大,它只有与钙等配合使用才可以促进钙的吸收,起到促进骨骼生长、改善贫血等功效。例如对闭经后的老年女性,可以防止其骨质疏松,对骨折者可缩短恢复期,尤其对于女性居多的贫血症患者的改善效果较为明显。

关于钙和CPP的配合使用,根据动物试验的体外试验结果,CPP-1CPP-2对钙的重量比在1.21以上为宜,CPP-3对钙的比例在0.351以上为宜。

粉末状的CPP很稳定,当混用于糕点面包之类焙烤食品中,由于需在180以上高温环境下加热20min左右,对CPP的稳定性有些影响。为此,可考虑在食品加工的后期添加CPP等办法,以避免CPP受高温作用影响其生理功能的发挥。CPP在饮料方面的应用一般没有什么特别的困难。

 

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